【一起读文献】Alzheimers Dementia：AD的新靶点药物--sigma-2受体拮抗剂CT1812的临床前研究

t导读：淀粉样β蛋白（Aβ）寡聚体是Aβ蛋白最有毒的结构形式之一，当它们在阿尔茨海默病（AD）患者的脑组织中积聚时，被认为会导致突触毒性和记忆障碍。sigma-2受体复合物的拮抗剂可有效地阻断Aβ寡聚体毒性已被证明，而CT1812是一种高度渗透入脑的口服小分子药物，可选择性与sigma-2受体复合物结合，而且在健康的老年志愿者中似乎安全且耐受性良好。Alzheimers & Dementia期刊近期发表了题为《Preclinical and clinical biomarker studies of CT1812：A novel approach to Alzheimer's disease modification》的研究论文，作者团队在临床试验（ClinicalTrials.gov NCT02907567）中，检测了CT1812对临床前AD模型中Aβ寡聚体病理生物学的影响，并评价了CT1812对轻中度AD患者脑脊液蛋白生物标志物的影响。在三个独立的AD临床前模型中，CT1812显著且剂量依赖地取代了与突触受体结合的Aβ寡聚体，促进了寡聚体进入脑脊液，增加了突触数量和神经元中蛋白的表达，并改善了转基因小鼠的认知能力。除此以外，CT1812还可显著增加AD患者脑脊液中Aβ寡聚体的浓度，降低突触蛋白和磷酸化tau片段的浓度，逆转多种AD相关蛋白在脑脊液中的异常表达。研究人员认为，这些临床前研究证明了CT1812对AD和Aβ寡聚体的新型疾病修饰作用机制，并提供了靶点结合和对AD患者基本疾病相关信号通路影响的证据，支持CT1812的进一步开发。

 CT1812的假想作用机制图

CT1812取代并阻止Aβ寡聚体结合，且在体外恢复疾病相关蛋白的表达和突触数量

作者先前发表的研究描述了无偏倚的专有文库筛选，以鉴定阻断Aβ寡聚体诱导的细胞内脂质膜转运率毒性的化合物，并认为该化合物的效力与sigma-2受体的亲和力相关。药物的化学特性优化了CT1812的设计。作者发现CT1812以高亲和力结合sigma-2受体（图1A，Ki = 8.5 nM），以低亲和力结合sigma-1受体（Ki = 63 nM）。在原代海马/皮层培养物中，CT1812在体外有效阻止和逆转合成Aβ寡聚体诱导的膜转运缺陷（21DIV，图1B），并防止了人AD患者脑源性寡聚体诱导的转运缺陷（图1 C）。

同时，CT1812还阻止了Aβ寡聚体与神经元上突触受体位点的结合（图2A，B，D），并且取代了已经结合的Aβ寡聚体（图2 C，E）。Aβ寡聚体在体外可诱导可逆性脊柱回缩，并引起相应的突触和突触蛋白的丢失。作者以细胞骨架结合蛋白drebrin（突触后表达）作为突触数量的标记，研究CT1812诱导的Aβ寡聚体置换对寡聚体诱导的培养大鼠神经元棘和突触丢失的影响。与空载体组比较，向神经元培养物中加入Aβ寡聚体（3小时）便可导致每个神经元的drebrin免疫反应性突触小点显著丢失（图2F上图，G）。这与使用超微结构体视学方法在诊断为轻度认知障碍的患者尸检海马中观察到的突触丢失程度相似。CT1812以剂量依赖的方式阻止寡聚体诱导的突触丢失（图2F底部，G）。此外，在加入Aβ寡聚体1小时后，再加入CT1812可使突触数量呈浓度依赖性地增加到正常水平（图2G）。突触蛋白表达的检测证实了以上结果。神经颗粒素（Neurogranin）在树突和突触后末梢表达（图2H），而突触结合蛋白-1（synaptotagmin-1）则在体外成熟的原代海马/皮层神经元的突触前末梢表达（图2K）。Aβ寡聚体可导致高表达神经颗粒素的神经元丢失28%（图2I），突触结合蛋白-1突触前末梢丢失37%（图2L）。CT1812可阻断这种丢失，并将两种蛋白的表达恢复到对照水平（图2J，M），提示CT1812介导的Aβ寡聚体从神经元突触的置换不但可阻止下游寡聚体所诱导的突触蛋白下调，同时还可抑制突触丢失，由此可见，CT1812有利于毒性寡聚体损伤的突触进行恢复。

CT1812取代Aβ寡聚体，并促进体内脑脊液和AD患者脑组织中的清除

为了在AD小鼠模型体内验证在体外所观察到的Aβ寡聚体的位移，作者采用了一种新型微量免疫电极（MIE）技术，该技术曾用于检测脑间质液（ISF）40中总Aβ浓度的快速动态变化。使用放置在海马的寡聚体特异性抗体A11包被的电极，在12月龄APP_Swe/PS1dE9转基因小鼠的ISF中检测Aβ寡聚体。与给药前基线相比，CT1812单次给药可导致海马ISF中Aβ寡聚体水平快速显著升高（图3A）。相比之下，在对照组小鼠中未观察到ISF增加。给药后Aβ寡聚体的快速升高在记录的时间范围内（120 min）降至基线水平。相反，海马ISF中的总Aβ水平（主要是单体）不受CT1812给药的影响（图3B），上述结果表明，CT1812选择性地降低Aβ寡聚体细胞外浓度，而不影响Aβ单体的水平。

作者进一步评估CT1812是否也可能在AD患者中发生位移，在10例AD患者死后获得的10μM新皮质组织切片上进行了离体结合实验（图3C-E）。在相同体积的相邻切片中加入浓度递增的CT1812或空载体孵育，随后去除上清液，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测组织切片中Aβ的表达情况，并用免疫荧光显微镜检测残留在组织切片中的Aβ。通过ELISA分析总Aβ的置换物质，结果显示浓度递增的CT1812增加了人脑组织释放的Aβ（图3D）：非变性蛋白印迹证实该物质为Aβ寡聚体（图3 C，E）。此外，CT1812在2μm区域诱导Aβ寡聚体免疫荧光强度呈浓度依赖性降低，该区域含有高浓度的寡聚体，包围着由致密硫代黄素-S标记的斑块核心（图3F，G），斑块本身也发生类似变化，但无统计学意义（图3H）。这些结果表明CT1812取代了AD患者脑组织中预结合的Aβ寡聚体。

最后，将包被A11的MIE放入转基因APP_swe/PS1dE9小鼠的侧脑室，检测脑脊液中的Aβ寡聚体，以确定Aβ寡聚体是否被CT1812取代。给药后，在脑脊液中检测到Aβ寡聚体水平显著升高，且呈剂量依赖性（图3I），并持续升高达2小时，提示Aβ寡聚体在脑内的置换可能导致脑脊液清除率增加。相反，脑脊液中的Aβ单体水平不受CT1812给药的影响（图3J），表明CT1812选择性地促进寡聚体（而非单体）从大脑清除进入脑脊液。

CT1812改善AD模型小鼠的认知功能

为明确CT1812保护突触是否与功能性行为改善相关，作者对AD老年转基因小鼠的认知功能进行了评估。转基因Thy1 huAPP^{Swe/Lnd +} 雄性小鼠（3.5~4.5月龄），以及同窝野生型（WT）小鼠，经灌胃给予空载体或CT1812（10 mg/kg），每日1次，持续9-10周。与空载体WT小鼠比较，CT1812处理WT小鼠的运动行为未见显著改变，认知能力也无变化。如预期，与空载体WT小鼠相比，在活动室试验（测量探索）､Y迷宫（测量空间工作记忆）和恐惧条件反射试验（测量厌恶性联想学习和记忆）中，空载体处理组存在显著缺陷。在水迷宫（图4A）､Y迷宫（图4B）和情境恐惧条件反射（图4C）中，与空载体组相比，CT1812处理组中可见空间学习和记忆显著改善。除了改善空间学习和记忆外，通过活动室测试评估的多动状态和恐惧条件反射测试评估的线索依赖性学习和记忆也观察到显著的改善。而在WT小鼠中，CT1812对任何认知测试的表现均无影响（图4A-C）。

先前在Thy1 huAPP^{Swe/Lnd +} 小鼠中进行的与CT1812密切相关的8种其他sigma-2受体拮抗剂的研究表明，只要脑内药物浓度高于理论上80%的受体占据阈值浓度，便可观察到行为改善，但斑块数量和Aβ单体浓度（ELISA法测定）无变化。Thy1 huAPP^{Swe/Lnd +} 小鼠接受10 mg/kg p.o.给药9-10周后，PK法测定CT1812的脑内浓度，结果证实受体结合率可达到估计值80%（图4D，末次给药后24小时脑浓度 = 19.9 ng/mL，受体结合率为84.4%，大于sigma-2受体Ki值的4倍）。综上所述，以上研究表明，大脑中CT1812的阈值浓度有效地改善了在huAPP^{Swe/Lnd +} AD小鼠模型中发现的认知缺陷。

 图4. CT1812改善了AD模型小鼠的学习和记忆缺陷

CT1812介导的突触保护和疾病修饰的临床生物标志物证据

在完成首次人体临床研究（NCT0257099729）后，CT1812进入到AD患者的临床试验。在一项1b/2a期双盲临床试验中，将简易精神状态检查（MMSE）中评分为18-26分的轻-中度AD患者，随机分配至接受三种剂量（90，280，560 mg）之一的CT1812或安慰剂，每日一次，持续28天，以确定安全性和耐受性。随机分组的患者平均年龄为70.2岁，体重指数为24.75 kg/m²。基线和第28天的脑脊液浓度表明安慰剂组或任何剂量组基线时均不存在CT1812。在第28天，CT1812的脑脊液平均浓度呈剂量依赖性升高（90 mg组为1.15 ng/mL，280 mg组为2.84 ng/mL，560 mg组为4.96）。与一项治疗时间有限的研究所预期的一致，在CT1812治疗组和安慰剂组中，认知功能探索性指标相对于基线的变化相似。在基线和研究结束时采集每例患者的脑脊液样本，使用靶向（ELISA､蛋白免疫印迹､液相色谱串联质谱[LC-MS/MS]）和非靶向（无偏倚的LCMS/MS蛋白质组学）方法检测蛋白;缺失样本和可变样本量减少了可用于后续分析的匹配基线和第28天患者脑脊液样本的数量。

使用蛋白凝胶电泳（蛋白免疫印迹法）检测第0天和第28天采集的每例患者脑脊液样本中Aβ寡聚体的浓度，并计算每例患者的变化百分比。由于每个给药组的AD患者人数较少，因此将CT1812剂量组合并，以便与安慰剂进行比较。治疗28天后，安慰剂治疗患者的脑脊液中Aβ寡聚体浓度有低于其自身基线水平的趋势，而CT1812治疗组患者的水平与安慰剂治疗组相比则显著增加（图5A）。这一发现与临床前研究一致，表明CT1812可以将大脑中的有毒Aβ寡聚物进行置换并清除到脑脊液中（图3I）。

与年龄匹配的认知功能正常个体相比，AD患者脑脊液中几种突触和轴突蛋白的浓度升高，是中枢神经系统突触受损的结果;部分标志物对疾病相关变化的敏感性高于其他标志物。在COG0102试验中，作者使用ELISA（神经颗粒素和神经纤维丝轻链[NfL]）或靶向LC-MS/MS（synaptotagmin-1，SNAP-25） 检测AD患者脑脊液中突触和轴突蛋白的浓度。28天时，CT1812治疗的AD患者脑脊液中神经颗粒素和突触结合蛋白-1的浓度低于安慰剂治疗的AD患者（图5B，神经颗粒素;图5C，突触结合蛋白-1），这与临床前证据一致，CT1812诱导突触从损伤中恢复。

作者还评价了脑脊液的无偏倚LC-MS/MS蛋白质组学测量数据对突触蛋白的影响（图5D）。在该患者队列脑脊液中检测到的3160种蛋白中，315种蛋白的丰度在CT1812和安慰剂治疗患者之间存在显著差异。使用三个独立的生物信息学平台（IPA Canonical Pathway [v51963813]，Metacore [v19.4 build 69900]，STRING [v11]）进行的通路分析表明，CT1812显著影响突触相关的通路，包括N-甲基-D-天冬氨酸受体运输､糖原激酶合成酶激酶-3β（GSK3 β）､Wnt信号转导，以及细胞骨架重组。考虑到AD患者的突触丢失，以及临床前证据表明CT1812挽救了突触数量，作者还对CT1812治疗后发生了变化的突触蛋白进行筛查。与安慰剂治疗的患者脑脊液相比，CT1812处理组中有25个突触蛋白具有差异表达。

在最近的一项研究中，与年龄匹配的对照组相比，在AD患者中显著改变的520种脑脊液蛋白中， COG0102 脑脊液蛋白质组学数据集中检测到334种。在这334种蛋白中，20种蛋白的子集向相反方向移动（即逆转AD相关变化），与安慰剂组比较，CT1812处理组也存在显著差异（图5E）。其中有部分蛋白参与了已知在AD中被破坏的关键生物学途径，包括胆固醇转运（载脂蛋白A2[APOA2]）､氧化应激（铜蓝蛋白[CP]）､补体（补体C1r亚成分样蛋白[C1RL]）和突触传递（14-3-3蛋白β/α[YWHAZ]）。这为CT1812广泛改善AD患者的疾病相关信号提供了支持性证据。

AD的特征之一是过度磷酸化的tau蛋白，它由神经纤维缠结（NFT）组成。作者通过LC-MS/MS对AD患者脑脊液中未磷酸化和磷酸化的tau蛋白片段浓度进行了评估，通过LC-MS/MS检测到代表tau上33个不同磷酸化位点的磷酸化多肽片段，并在CT1812或安慰剂治疗28天后采集脑脊液中未磷酸化和磷酸化的tau蛋白片段（图5F）。CT1812治疗后，与安慰剂相比，6个磷酸化位点的丰度降低了30%或更多（图5F），其中一个位点的丰度增加了30%以上，但未磷酸化的tau的浓度未见变化。综上所述，这些临床生物标记物数据支持CT1812对AD患者的潜在治疗作用。

CT1812既是第一个用于临床试验的选择性sigma-2受体拮抗剂，也是第一个针对突触受体位点上Aβ寡聚体作为治疗靶点，并选择性地促进它们进入脑脊液的药物。CT1812在啮齿类动物AD模型中的这些临床前结果证明CT1812可阻断Aβ寡聚体与神经元结合，减少突触丢失，恢复突触蛋白表达，促进寡聚体清除进入脑脊液，恢复认知功能。CT1812能够改善转基因小鼠的认知能力，同时不影响WT小鼠，这支持了CT1812对AD病理途径的特异性，这种选择性机制可能比其他更广泛影响大脑功能的治疗方法更具优势。

精读文献请下载原文：

Izzo Nicholas J，Yuede Carla M，LaBarbera Kelsie M et al. Preclinical and clinical biomarker studies of CT1812：A novel approach to Alzheimer's disease modification. Alzheimers Dement. 2021. doi：10.1002/alz.12302.

编译 / 周    煦

校 审 / 梁春梅

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